在一次性生產(chǎn)解決方案初次發(fā)布后不久，一次性技術(shù) （SUT）就被行業(yè)接受。從市場的角度來看，單克隆抗體(mAb)代表了一個重要的產(chǎn)品類別，該等實(shí)體的生產(chǎn)平臺具有高度一致性的特點(diǎn)。因此，設(shè)備供應(yīng)商最初專注于開發(fā)用于制造該產(chǎn)品組的設(shè)備和相關(guān)一次性組件。因此，設(shè)備供應(yīng)商最初專注于用于生產(chǎn)該產(chǎn)品組的設(shè)備和相關(guān)一次性組的開發(fā)。
在過去十年中，抗體偶聯(lián)物藥物（ADC），在廣義上也稱為生物偶聯(lián)物，采用了一次性制造技術(shù)。這一趨勢是由產(chǎn)品安全考慮(避免交叉污染)和職業(yè)暴露限制(OEL)要求驅(qū)動的。盡管最初在臨床上遇到了挫折，但ADC代表了一個不斷增長的細(xì)分市場，有70多種產(chǎn)品處于臨床開發(fā)階段，并推出了4種產(chǎn)品，即Kadcyla™（羅氏基因泰克），Adcetris™（西雅圖遺傳學(xué)），Mylotarg™和Besponsa™（輝瑞）。
從作用方式的角度來看，ADC被認(rèn)為是化療藥物，因?yàn)樗鼈兘Y(jié)合了小分子的細(xì)胞毒性或細(xì)胞抑制活性與mAb的選擇性。抗體單元特異性地識別腫瘤抗原，因此，有效載荷可以傳遞到所需的靶標(biāo)。這些有效載荷的全身毒性太高，無法在沒有靶向功能的情況下使用。一個關(guān)鍵的生產(chǎn)步驟是在mAb和高效有效載荷（即活性藥物成分（HPAPI））之間形成共價(jià)化學(xué)鍵，也稱為“彈頭"或“毒素"。常見的有效載荷是美登素類化合物（DM1和DM4），奧利他?。∕MAE和MMAF）和吡咯苯二氮卓類（PBD）衍生物，后者顯示出最高的效力。有效載荷通過不同復(fù)雜性的連接子與mAb偶聯(lián)。在大多數(shù)情況下，這些連接子與mAb恒定結(jié)構(gòu)域中的半胱氨酸或賴氨酸殘基結(jié)合。半胱氨酸基和賴氨酸基偶聯(lián)示意性地顯示在圖1中。有關(guān)ADC結(jié)構(gòu)和功能方面的更多詳細(xì)信息，我們向感興趣的讀者推薦Hoffmann等人的評論論文。
除上述ADC外，術(shù)語生物偶聯(lián)物還包括其他化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)通常不被歸類為HPAPI，例如：
● 聚合物（例如聚乙二醇、淀粉和聚唾液酸）偶聯(lián)mAb，其中聚合物單元的功能是改變mAb的藥代動力學(xué)
● mAb與抗生素偶聯(lián)，可有效靶向治療細(xì)菌感染
● mAb與結(jié)合放射性核素的螯合劑偶聯(lián)，用于向靶向癌細(xì)胞遞送細(xì)胞毒性輻射（放射免疫療法）
● 弱抗原（例如細(xì)菌多糖）與蛋白質(zhì)性質(zhì)的強(qiáng)抗原的結(jié)合疫苗，可引發(fā)針對弱抗原的更強(qiáng)免疫應(yīng)答
雖然選擇性通常通過使用完整的單抗來保證，但該功能可以由工程抗體(如片段抗原結(jié)合(Fab)、單鏈可變片段(scFv)、單域抗體(sdAb)或另一種抗體模擬支架(affbody、DARPin、anticalin、alphabody等)來替代。 生物偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，加上ADC的高效能，使得這些產(chǎn)品的生產(chǎn)成為一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。
2007 年，龍沙是投資專用生物偶聯(lián)設(shè)施的合同制造組織之一，當(dāng)時(shí)的重點(diǎn)是 ADC。在調(diào)試后的 10 年中，該設(shè)施發(fā)布了來自 30 多種不同產(chǎn)品的 500 多個臨床和商業(yè)批次。玻璃和不銹鋼多用途設(shè)備用于初始生產(chǎn)，一次性技術(shù)的采用僅限于無菌過濾器、轉(zhuǎn)移管、取樣裝置和儲物袋。2014年，推出了一個一次性的生產(chǎn)平臺，該平臺包括 50-200L一次性混合袋技術(shù)和切向流過濾 （TFF） 撬塊，適用于高達(dá)3 m2 的膜面積。從那時(shí)起，大多數(shù)臨床項(xiàng)目都是在更大規(guī)模的端到端SUT生產(chǎn)設(shè)置中執(zhí)行的。這一發(fā)展是由以下好處推動的：
● 降低操作人員接觸有毒化合物的風(fēng)險(xiǎn)
● 避免了每個HPAPI的生產(chǎn)都需要專用設(shè)備，這在項(xiàng)目周轉(zhuǎn)率高的情況下是一個重大缺陷
● 由于消除了交叉污染問題，縮短了生產(chǎn)中的實(shí)施時(shí)間;從清潔風(fēng)險(xiǎn)評估開始，擴(kuò)展到執(zhí)行試樣研究、開發(fā)特定產(chǎn)品的清潔程序和清潔驗(yàn)證的清潔計(jì)劃已經(jīng)過時(shí)
● 考慮到ADC的穩(wěn)定增長正在挑戰(zhàn)現(xiàn)有分析方法的檢測和量化極限，減少清潔監(jiān)測的分析工作
● 減少清潔過程中有毒廢物流的數(shù)量。
本章下一節(jié)將討論使用基于聚合物的生產(chǎn)設(shè)備的缺點(diǎn)，描述ADC制造中一次性解決方案的開發(fā)進(jìn)展。
在ADC工藝中使用一次性產(chǎn)品挑戰(zhàn)
有機(jī)溶劑的使用
一個挑戰(zhàn)是產(chǎn)品接觸表面暴露于有機(jī)溶劑中，這可能會對物理穩(wěn)定性產(chǎn)生負(fù)面影響，并可能導(dǎo)致可浸出物水平升高。美國食品和藥物管理局和歐洲藥品管理局的法規(guī)明確規(guī)定，包括一次性使用系統(tǒng)在內(nèi)的加工設(shè)備不應(yīng)對產(chǎn)品安全和質(zhì)量造成任何危害。典型的親脂性負(fù)載通常溶解在有機(jī)溶劑中，極性非質(zhì)子溶劑如二甲亞砜，二甲基甲酰胺，或二甲基乙酰胺是常用的。另外化學(xué)反應(yīng)通常在含有10-25%有機(jī)溶劑的緩沖水溶液中進(jìn)行，以便在偶聯(lián)步驟中保持小分子的溶解度。隨后的純化步驟應(yīng)設(shè)計(jì)為清洗溶劑、可浸出物、偶聯(lián)試劑（即活化劑）、非偶聯(lián)有效載荷和淬滅劑。與工藝溶液接觸的一次性材料應(yīng)仔細(xì)評估在所選溶劑濃度和工藝條件下的相容性。Weibing Ding[8]指出了在基于科學(xué)的風(fēng)險(xiǎn)評估中需要考慮的以下方面：（i）工藝流體和一次性系統(tǒng)之間的化學(xué)相容性，（ii）產(chǎn)品成分，（iii）材料接觸面積，（iv）接觸時(shí)間，（v）工藝溫度，（vi）預(yù)滅菌方法，以及（vii）與最終容器封閉系統(tǒng)的距離。
幸運(yùn)的是，大多數(shù)生物工藝容器和一次性混合袋的產(chǎn)品接觸層由聚乙烯組成，聚乙烯與溶劑含量低于25%的水溶液相容。然而，一次性組件，如由聚砜、聚醚砜、聚碳酸酯或聚偏二氟乙烯制成的連接器可能對類似的水溶劑混合物的抵抗力較低，這可能導(dǎo)致化學(xué)品浸出增加，從而影響產(chǎn)品質(zhì)量。此外，與25-100%的溶膠排放含量相關(guān)的問題也帶來了挑戰(zhàn)，這可以通過在一次性使用模式下使用玻璃瓶和不銹鋼連接器來解決。
總之，全面的可浸出物風(fēng)險(xiǎn)評估和仔細(xì)選擇一次性使用的設(shè)備組件相結(jié)合，可以將最終產(chǎn)品中的可浸出物濃度降低到可接受的水平。
HPAPI的安全性和處理
ADC生產(chǎn)需要處理具有細(xì)胞抑制或細(xì)胞毒性特征的高效成分。因此，需要特別注意職業(yè)安全和健康以及避免交叉污染。因此，保護(hù)雇員或合同工人不因接觸在制造過程中處理的化學(xué)品而對健康產(chǎn)生任何負(fù)面影響是至關(guān)重要的。化工行業(yè)已經(jīng)為化合物（包括藥物中間體和藥物）制定了分類系統(tǒng)，該系統(tǒng)基于定義OELs，即工作區(qū)域空氣中定義的化學(xué)品的最大可接受濃度。隨著時(shí)間的推移，建議的分類系統(tǒng)已經(jīng)演變成SafeBridge標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)有四個類別。用于ADC生產(chǎn)的化學(xué)品的典型OELs范圍在100到1ng/m3之間。
在工人保護(hù)和職業(yè)健康方面的圣杯是“封閉式制造"，與固定不銹鋼管道互連的不銹鋼設(shè)備是封閉式生產(chǎn)的經(jīng)典解決方案。然而，近年來，我們已經(jīng)能夠證明，從職業(yè)安全和交叉污染控制的角度來看，商用一次性設(shè)備是一個不錯的選擇，并且可以得出結(jié)論，一次性工藝解決方案非常適合封閉、無菌的處理。所選溶液工作可靠，能夠承受偶聯(lián)過程所需的相當(dāng)溫和的反應(yīng)條件（溫度、壓力和溶劑濃度），因?yàn)楦吒g性的工藝條件也對mAb有害。
許多公司細(xì)分為六個產(chǎn)品類別（安全橋1和2為三個類別，安全橋3和4為3類）。這允許工作標(biāo)準(zhǔn)定義具有更高的粒度。下表總結(jié)了中概述的信息。
用萘普生模擬典型接合過程的替代研究經(jīng)常進(jìn)行，以驗(yàn)證遏制。生產(chǎn)區(qū)域的表面拭子和空氣中顆粒的監(jiān)測為生產(chǎn)設(shè)備和設(shè)施的適用性提供了證據(jù)。
關(guān)鍵單元操作
1 攪拌罐中的反應(yīng)
除了轉(zhuǎn)移，在生產(chǎn)生物偶聯(lián)物時(shí)需要考慮的關(guān)鍵單元操作是攪拌槽、TFF、柱層析、在線過濾和凍融循環(huán)中的反應(yīng)。
傳統(tǒng)的生物制藥生產(chǎn)主要使用一次性的攪拌槽來保持中間產(chǎn)品溶液的均勻性，而生物偶聯(lián)物的生產(chǎn)涉及在一次性攪拌槽中進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)。這些例子包括（i）mAb的還原（半胱氨酸偶聯(lián)），（ii）選擇性再氧化，以及（iii）連接子有效載荷與mAb的偶聯(lián)。對于某些試劑添加步驟，所得反應(yīng)溶液的快速均質(zhì)化對于獲得所需的產(chǎn)品關(guān)鍵質(zhì)量屬性以及獲得多個批次的可重現(xiàn)產(chǎn)品曲線至關(guān)重要。由于試劑可充注于有機(jī)溶劑中，因此一次性設(shè)備應(yīng)保證在適當(dāng)短的時(shí)間范圍內(nèi)將水相和有機(jī)相混合到均勻的溶液中。
2 切向流過濾
在ADC生產(chǎn)中，TFF用于（i）清除溶劑，（ii）去除小分子反應(yīng)物，如氧化劑和還原劑或過量的連接子有效載荷，（iii）緩沖液的交換，（iv）（中間）產(chǎn)物的濃度。根據(jù)藥物特性和目標(biāo)藥物濃度，產(chǎn)品溶液可能變得非常粘稠。在我們的設(shè)施中引入端到端一次性生產(chǎn)ADC時(shí)，市售TFF設(shè)備和相關(guān)流量組的設(shè)計(jì)只能承受2.5 bar（g）的壓力。因此，龍沙團(tuán)隊(duì)不得不重新設(shè)計(jì)和調(diào)整流量組，以抵抗更高的壓力。重新設(shè)計(jì)的一次性 TFF 歧管可在高達(dá) 4 bar（g） 的進(jìn)料壓力下運(yùn)行。最初可用的 1/2“ TFF 撬塊僅限于 3 m2 膜面積，這將批量大小限制為 100-200 g 蛋白質(zhì)。最近推出的 1“ 一次性 TFF 撬塊可容納高達(dá) 10 m2 的膜面積，典型批量大小可達(dá) 1 kg，從而擴(kuò)大了 SUT 在 ADC 制造中的應(yīng)用范圍。使用后處理與產(chǎn)品接觸的材料（包括膜和歧管）大大減少了處理受污染設(shè)備所需的時(shí)間，并將清潔過程中產(chǎn)生的有毒廢物和需要特定處理的廢物的數(shù)量降低。
3 色譜法
雖然早期的ADC產(chǎn)品避免了色譜步驟，但臨床開發(fā)中許多產(chǎn)品的過程包括精純步驟，通常用于去除大分子產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)。從操作的角度來看，最好使用預(yù)填充柱，因?yàn)檫@些可以在不打開的情況下處理，從而避免操作員接觸高效化合物，這種風(fēng)險(xiǎn)在多用途色譜柱的拆包過程中特別高。
4 過濾和轉(zhuǎn)移
在生物制藥生產(chǎn)的情況下，0.2毫米過濾操作基本上服務(wù)于生物負(fù)荷控制的目的。深度過濾偶爾用于去除加工過程中形成的骨料。蠕動泵與生物丁橡膠管相結(jié)合，適用于標(biāo)準(zhǔn)輸送和過濾步驟。由于其接觸面積大，工藝過濾器在可提取物和可浸出物風(fēng)險(xiǎn)評估中需要高度關(guān)注。
5 原液凍融
根據(jù)藥品生產(chǎn)場所的工藝量和能力，生物偶聯(lián)原料藥(BDS)在-20℃或-65℃以下冷凍和儲存之前被釋放到冷凍容器、二維 (2D) 袋、大瓶或瓶子中。從操作角度來看，冷凍容器和袋子比瓶裝解決方案更受青睞，因?yàn)樗鼈兛梢赃M(jìn)行密閉分裝，而無需“A 級"潔凈室環(huán)境。
使用2D袋作為5-20升體積的冷凍容器已經(jīng)變得非常流行。其原因是（i）溶液的一次性使用性質(zhì)，（ii）使用配備無菌連接器和斷開器的歧管的封閉分裝能力，（iii）提高可擴(kuò)展性，（iv）開發(fā)用于安全運(yùn)輸?shù)谋Ｗo(hù)殼，（v）對低溫濃縮效應(yīng)和袋子儲存的良好控制，以及（vi）更高的冷藏室儲存密度。上述保護(hù)殼的開發(fā)有助于克服諸如在低于-65°C的溫度下袋脆性增加等弱點(diǎn)。需要考慮聚合物的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度以及端口和管道在運(yùn)輸過程中承受機(jī)械應(yīng)力的情況。另一個可取的特點(diǎn)是與凍融設(shè)備解決方案的連接性和靈活性，例如板式凍融裝置和靜態(tài)或具有主動空氣再循環(huán)的鼓風(fēng)冷凍機(jī)，以避免投資購買額外的設(shè)備。由于凍融速度會影響產(chǎn)品質(zhì)量，因此控制凍融的趨勢也很明顯。
半胱氨酸偶聯(lián)過程–ADC生產(chǎn)工藝案例研究
半胱氨酸偶聯(lián)過程在龍沙ADC設(shè)施中的一次性設(shè)備中端到端運(yùn)行，每批提供數(shù)百克ADC。這種一次性的生產(chǎn)設(shè)置使內(nèi)毒素控制到某些治療適應(yīng)癥所需的非常低的濃度。偶聯(lián)和滲濾步驟在一次性混合袋中進(jìn)行，混合袋的處理體積在 10 至 200 L之間，含有 200g API。
該過程從使用還原劑解凍和還原mAb開始；常用的還原劑是三（2-羧乙基）膦（TCEP）的水溶液，可將mAb的分子間二硫鍵還原為兩個硫醇基團(tuán)。標(biāo)準(zhǔn)的一次性混合袋非常適合此操作。第一代半胱氨酸偶聯(lián)過程直接進(jìn)入偶聯(lián)步驟，這通常導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)學(xué)分布的藥物抗體比（DAR）為0-8。ADC藥物具有特定的平均DAR，通常在2-4范圍內(nèi).如表4.所示，第二代半胱氨酸與工程抗體的偶聯(lián)過程引入了選擇性再氧化步驟（通常使用脫羥基抗壞血酸），該步驟只保留選定的硫醇功能，并恢復(fù)mAb中確定位置的二硫鍵。這種還原后選擇性再氧化的過程是位點(diǎn)選擇性結(jié)合的先決條件。在偶聯(lián)步驟之后，這導(dǎo)致具有相同兩個硫醇偶聯(lián)且DAR為2的單產(chǎn)物物種。 在選擇性再氧化之前，過量的還原劑通過在單次使用的TFF設(shè)備中進(jìn)行透析過濾來去除。然后對還原的mAb進(jìn)行選擇性再氧化。
在下一步中，mAb中剩余的硫醇功能與一定量的連接子有效載荷分子偶聯(lián)，并在反應(yīng)完成后淬滅過量的藥物連接子（N-乙酰半胱氨酸已被確定為合適的淬滅試劑）。然后在TFF操作或隨后的精純色譜步驟中清除工藝雜質(zhì)。后者使用預(yù)填充柱在一次性色譜撬塊上運(yùn)行，以提供數(shù)百升規(guī)模的高純度產(chǎn)品。在ADC生產(chǎn)中使用預(yù)填充柱與一次性設(shè)備結(jié)合使用被證明特別有益，因?yàn)椋?/span>
● 對色譜柱填料和拆包設(shè)備沒有要求
● 節(jié)省了包裝和拆包色譜柱的時(shí)間;色譜柱還可以在一次性模式下靈活使用，也可以清潔和儲存以進(jìn)行多次使用和
● 職業(yè)暴露風(fēng)險(xiǎn)降低；HAPI污染樹脂的開放式處理需要采取重大的密閉措施，以確保操作人員的安全并控制交叉污染風(fēng)險(xiǎn)。
然后，精純步驟的產(chǎn)品池通常以10-20倍的倍數(shù)濃縮至通常超過10克/升的目標(biāo)濃度?？紤]到高濃度因素，還應(yīng)將設(shè)備滯留因素考慮在內(nèi)。此外，小分子偶聯(lián)伴侶的高濃度和特性會影響粘度。
濃縮產(chǎn)品最終配制成BDS，過濾并填充到PETG瓶或2-D袋中，冷凍至-20°C以下或-65°C以下。 必須注意避免低溫濃縮效應(yīng)，這可能會對產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響。
總結(jié)和結(jié)論
ADC和其他生物偶聯(lián)物的生產(chǎn)要求嚴(yán)格，以確保產(chǎn)品質(zhì)量和安全的工作條件。此外，有機(jī)合成與生物加工中更常用的技術(shù)相結(jié)合是相當(dāng)不尋常的。然而，正是與生物工藝的接近鼓勵了利用SUT制造ADC。許多優(yōu)點(diǎn)包括改善職業(yè)暴露風(fēng)險(xiǎn)狀況，降低投資成本，特別是臨床生產(chǎn)方面，顯著降低交叉污染問題，以及大大減少清潔過程中的有毒廢物流。與不銹鋼設(shè)備生產(chǎn)相比，使用聚合物基接觸材料的一個缺點(diǎn)是可浸出物風(fēng)險(xiǎn)增加。然而，正如許多活動所證明的那樣，這種風(fēng)險(xiǎn)可以通過可浸出物風(fēng)險(xiǎn)評估和細(xì)致地選擇一次性生產(chǎn)解決方案來管理。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，SUT在ADC生產(chǎn)中的利用率在安全性、設(shè)備功能和總體項(xiàng)目成本方面是相當(dāng)或更優(yōu)。 如本文所示，如今可以使用一次性設(shè)備成功生產(chǎn)ADC?，F(xiàn)有的規(guī)模限制將逐步克服，結(jié)合一次性設(shè)備方面的進(jìn)展，將確認(rèn)SUT進(jìn)一步應(yīng)用的趨勢。此外，目前用于ADC生產(chǎn)的技術(shù)解決方案可能為在化學(xué)制造的其他領(lǐng)域?qū)嵤┮淮涡栽O(shè)備鋪平道路。
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